Terapia celular regenerativa

Esta terapia se basa en introducir nuevas células en un tejido para poder tratar una determinada patología. Se aplica sobre tejidos dañados como consecuencia de lesiones traumáticas, o enfermedades degenerativas crónicas.

En nuestra clínica estamos aplicando principalmente células madre mesenquimales y plasma rico en factores de crecimieto plaquetario. Puedes encontrar más información sobre esta nueva terapia en el siguiente enlace de nuestro blog o en el artículo adjunto (publicado en http://argos.portalveterinaria.com/noticia/11322/Articulos/pda/)

Uso de células progenitoras mesenquimales en el tratamiento de la osteocondritis disecante en perros

Tres casos clínicos

 Alberto Blanco Robledano[1], Óscar Amor Carro[2*], María Velaz Encinas [1], María Isabel Rodríguez García[2], María Ángeles Rejos Lozano[1], Manuel Hermida Prieto[2], Luis Mariñas Pardo[2]

1. Clínica Veterinaria Arturo Soria, Madrid
2. Centauri Biotech S.L., Arteixo (A Coruña)

Las terapias basadas en células progenitoras mesenquimales son cada vez más usadas en veterinaria. Están indicadas principalmente en osteoartritis y lesiones de tendón, pero también en otras patologías con un componente inmunitario.

En el caso de la osteocondritis disecante, el tratamiento con células progenitoras mesenquimales podría ser una alternativa terapéutica a los tratamientos clásicos basados en cirugía y antiinflamatorios.

Introducción

La osteocondritis disecante (OCD) es una condición en la que un fragmento de cartílago articular, junto con el hueso subcondral subyacente, se separa parcial o totalmente del tejido cartilaginoso circundante. Puede afectar tanto a individuos adultos como juveniles. Aunque la etiología exacta de la enfermedad es desconocida, se especula que la causa puede ser una deficiencia en el aporte sanguíneo al hueso subcondral (1). La OCD degenera en daño del cartílago articular, inflamación crónica, dolor y pérdida de funcionalidad de la articulación.

Las células progenitoras mesenquimales (CPM) o células madre mesenquimales, son una población de células multipotentes que se encuentran en diferentes tejidos del individuo adulto. La característica más relevante para su utilización terapéutica a corto plazo es su capacidad de modulación del sistema inmunitario (2-4). También son capaces de inhibir la fibrosis y la apoptosis y mejorar la angiogénesis en los procesos de reparación tisular (5, 6).

Las patologías que en general mejor responden al tratamiento con células madre son las que tienen un componente inflamatorio, como es el caso de la OCD. La terapia clásica de las patologías articulares se basan en la administración de antiinflamatorios (7, 8) que controlan la inflamación a corto plazo. Además, en la última década, se han investigado tratamientos alternativos. En concreto en perros, se usan CPM en el tratamiento de osteoartritis y como complemento para mejorar la recuperación tras lesiones traumáticas (9-11). Sin embargo, hasta la fecha no disponemos de datos sobre la seguridad y la eficacia del uso de CPM en el tratamiento de la OCD canina.

En el presente estudio se pretendía evaluar la seguridad y eficacia del tratamiento con CPM administradas intraarticularmente, en perros con cojera crónica derivada de OCD. El tratamiento con CPM, por sí solas o administradas posteriormente a una artroscopia articular, ha supuesto una mejoría de los síntomas y la evolución de animales con OCD.

Material y métodos

Casos

Se incluyeron un total de tres perros diagnosticados de OCD y tratados mediante cirugía articular y CPM. Los pacientes presentaban cojera marcada de más de dos meses de evolución en el momento del tratamiento (ver detalle de los casos en la tabla 1). El origen de la cojera fue natural en los tres casos y cursaba con remodelación ósea y presencia de osteofitos. Los animales estaban tratados previamente con antiinflamatorios y/o condroprotectores sin experimentar mejoría duradera.

Evaluación clínica

Los animales fueron evaluados antes del tratamiento mediante un examen físico para identificar inflamación, dolor a la palpación y grado de extensión de las articulaciones afectadas. Todos los casos fueron diagnosticados de OCD con presencia de osteofitos mediante tomografía computarizada (TC). Los informes de TC fueron realizados por el mismo especialista de diagnóstico por imagen en el Centro Médico Veterinario Delicias. Tras confirmar el buen estado general se les indicó el tratamiento quirúrgico de la OCD y la extracción de grasa abdominal para la obtención de CPM autólogas. El tratamiento intraarticular con CPM se realizó aproximadamente un mes tras la artroscopia.

Cirugía

Los pacientes fueron sometidos a cirugía articular para limpieza artroscópica, curetaje del cartílago y osteotomía cuando fue necesaria. Se aprovechó la anestesia del paciente para realizar una pequeña incisión abdominal y extraer una muestra de grasa (9 – 21 g).

Tratamiento autólogo con CPM

Obtención de CPM

Las CMP utilizadas han sido obtenidas en los laboratorios de Centauri Biotech, siguiendo procedimientos normalizados de trabajo basados en métodos previamente descritos (12, 13) y de acuerdo a normas de buenas prácticas de laboratorio. La grasa se digirió con colagenasa IV (Serva Electroforesis) y las células obtenidas se cultivaron en medio DMEM suplementado (Biowest). Las células no adherentes se descartaron mediante el lavado de la superficie de cultivo con PBS. Una vez superado el 75 % de confluencia, los cultivos se levantaron con tripsina (Biowest) y se expandieron hasta un máximo de cuatro pases.

Las CPM se marcaron con anticuerpos monoclonales frente a CD90, CD44, CD73, CD3, CD45 y CD11/18 (BD Bioscience) y se analizaron mediante citometría de flujo (FacScalibur, BD Biosciences). La capacidad multipotencial de las CPM se comprobó mediante ensayos de inducción de diferenciación hacia adipocitos, osteocitos y condrocitos. Las células usadas tenían una viabilidad mayor del 90 % en el momento del envío al hospital veterinario.

Dosis y procedimiento de administración

La administración de CPM se realizó en forma de inyección intraarticular, a razón de cinco millones de CPM resuspendidas en 1 ml de excipiente (DMEM, Biowest) por articulación. En cada animal se trataron de dos a seis articulaciones simultáneamente. La inyección intraarticular se realizó de acuerdo a técnicas bien descritas en la literatura (14). Los animales fueron monitorizados durante al menos una hora para registrar cualquier evento adverso debido a la administración intraarticular de CPM. Se realizó un seguimiento exhaustivo del paciente durante al menos dos meses tras el tratamiento con CPM.

Resultados

Caracterización de CPM derivadas de tejido adiposo expandidas

Las CPM obtenidas cumplen las características de células madre mesenquimales (15). Las células se expandieron in vitro en un número bajo de pases (2 – 4 pases). La población de CMP expandidas de pase más elevado expresaba CD90, CD44 y CD73 y carecían de la expresión de CD3, CD45 y CD11/18 en la superficie celular (figura 1). Así mismo, las CMP fueron capaces de diferenciarse a adipocitos, osteocitos y condrocitos.

Evaluación de la seguridad del tratamiento

Los tres animales se recuperaron satisfactoriamente de la cirugía articular y de la posterior inyección intraarticular de CPM. Ninguno de los animales tratados presentó reacciones adversas, locales o sistémicas, durante el periodo de observación inicial de 24 h postratamiento. Tampoco se indicaron efectos adversos durante un periodo de seguimiento de dos meses.

Evaluación de la eficacia del tratamiento de OCD con CPM

Los perros presentaron diferentes grados de mejoría clínica en cuanto a disminución o desaparición de la cojera, dolor a la palpación, resistencia a la extensión forzada de la articulación y mejoría del rango de movilidad. La respuesta al tratamiento fue positiva en los tres casos, pero diferente según la naturaleza y gravedad de la patología.

El caso I presentaba una alteración de la marcha de dos meses de evolución. Se trató con antiinflamatorios y condroprotectores y, aunque inicialmente mejoró, al mes volvió a cojear ostensiblemente. Se realizó analítica y control de tiroides que dieron valores normales. Se le realizó TAC y se le diagnosticó displasia de codo bilateral, fragmentación del coronoides y OCD humeral con efusión sinovial (figura 2). Se le realizó artroscopia de ambos codos, osteotomía de codo derecho y una recolección de muestra de tejido adiposo subcutáneo en la zona abdominal. Se le administraron CPM en ambos codos mediante inyección intraarticular. Se mantuvo el tratamiento con antiinflamatorios cada tres días durante todo el seguimiento. El perro evolucionó favorablemente y a los 60 días postratamiento con CPM había mejorado la cojera al trote y aumentado el rango de extensión máxima de ambos codos, no siendo dolorosa a la manipulación. Un año después el perro presentaba una actividad normal.

Figura 2. Informe de tomografía diagnóstica del caso I. En el codo izquierdo (A – C) hay un fragmento (6x4x2mm, imagen A, flecha verde) craneal al proceso coronoides medio con zonas mal definidas de disminución de densidad. Se observa también un defecto de gran tamaño (flehas rojas, imagen B) rodeado por esclerosis, y un ratón articular en la fosa olecraneana del húmero, craneal al proceso ancógeno (flechas verdes, imagen C. Así mismo hay múltiples osteofitos en los márgenes articulares y ligera incongruencia articular (imagen C). En el codo derecho (D – E) se observan cambios análogos a los del codo izquierdo, pero más severos. El fragmento coronoides es de mayor tamaño (imagen D, flecha verde), la osteoartritis es más avanzada y la incongruencia articular severa (imagen E), con efusión sinovial también severa (imagen F, flechas verdes). Estudio de tomografía realizado en Centro Médico Veterinario Diagnóstico por Imagen.

El caso II sufría una cojera de la extremidad anterior derecha desde hacía dos meses. Se realizó TAC y se diagnosticó de OCD bilateral en hombros (figura 3). Se le realizó una artroscopia del hombro derecho para limpieza de osteofitos, sección del tendón bicipital y raspado y curetaje de la cabeza humeral. Se aprovechó para la extracción de una pequeña muestra de tejido graso de la zona abdominal. Un mes después de la cirugía, se realizó una extracción de 2 ml de líquido sinovial previa a la administración de CPM en ambos hombros. El paciente experimentó mejoría desde la primera semana postratamiento con CPM y no precisó tomar antiinflamatorios. A los dos meses no cojeaba y corría y saltaba con normalidad, sin manifestar ningún dolor. La exploración reveló mínima resistencia a la extensión forzada de la articulación del hombro derecho comparada con el izquierdo.

Figura 3. Informe de tomografía diagnóstica del caso II. En el hombro derecho (A, B) se aprecia osteofitos en el borde caudal y ventral de la cabeza del húmero (imagen A, flechas verdes), lesión subcondral con tenosinovitis asociada e irregularidades en la zona de inserción del bíceps braquial (imagen B, flechas verdes). En el hombro izquierdo (C) hay una lesión (flecha verde) en el borde lateral del tubérculo mayor con irregularidad y esclerosis así como microosteofitos en área de inserción tendinosa del infraespinoso. Estudio de tomografía realizado en Centro Médico Veterinario Diagnóstico por Imagen.

El caso III presentaba una cojera de extremidad anterior derecha y displasia de cadera diagnosticadas por TAC (figura 4). Presentaba además incongruencia, fragmentación de procesos coronoides y lesión del cartílago humeral en ambos codos. Se observaron además cápsulas sinoviales engrosadas en los hombros. Las analíticas sanguíneas fueron negativas para Leishmania, Erhlichia, Borrelia, Anaplasma y Filaria. Se le realizó artroscopia del codo izquierdo para la extracción de fragmentos del proceso coronoides y osteotomía de cúbito derecho. Se aprovechó la intervención para extraer una muestra de grasa de la zona abdominal. Un mes después de la artroscopia, se le administró CPM en seis articulaciones (cadera, codos y hombros). Dos meses tras la aplicación de las células no tenía cojera en frío ni dolor a la exploración de ninguna articulación, sólo levemente la flexión máxima del codo derecho. Ambos hombros se podían luxar, sin reflejar dolor ni sentirse crepitación.

Figura 4. Informe de tomografía diagnóstica del caso III. El codo izquierdo presenta esclerosis severa y numerosos fragmentos en el proceso coronoides medial, con un fragmento en forma piramidal de gran tamaño (5x5x5 mm, imagen A, flecha roja). En el codo derecho la congruencia articular es mala y el proceso coronoides está severamente remodelado y acortado con signos de esclerosis severa. También hay esclerosis en el cóndilo humeral con un gran defecto subcondral (imagen B, flechas verdes). En los hombros el volumen de la capsula sinovial está ligeramente aumentado en ambos lados (no mostrado). En las caderas hay subluxación bilateral de las articulaciones coxofemorales (imágenes C y D, flechas verdes), con márgenes acetabulares severamente remodelados y producción ósea alrededor de las cabezas y los cuellos femorales (flechas rojas). Las cápsulas sinoviales están severamente distendidas con un aumento muy marcado de líquido sinovial, más severo en lado derecho (imagen E, flecha verde). Estudio de tomografía realizado en Centro Médico Veterinario Diagnóstico por Imagen.

Discusión

En el presente trabajo se estudió la seguridad y la eficacia del tratamiento de la OCD canina con CPM. Para ello realizamos tratamientos piloto con CPM administradas por vía intraarticular, en algunos casos un mes tras la artroscopia de indicación terapéutica.

Ningún animal presentó reacciones adversas en los dos meses posteriores a la administración intraarticular de CPM. Incluso uno de los casos, en el que se han administrado seis tratamientos simultáneos en hombros, codos y cadera (30 millones de CPM en total), no ha mostrado efectos secundarios. Esto coincide con estudios que afirman que el tratamiento con CPM es bien tolerado y las células no son rechazadas por el sistema inmunitario del receptor, incluso cuando son de origen heterólogo (16, 17).

La caracterización de CPM a pase cuatro, nos hace identificar las células usadas inequívocamente como CPM. Actualmente no hay marcadores específicos de células madre mesenquimales, y el establecimiento de un panel consenso de marcadores es todavía controvertido. El conjunto de receptores de superficie que expresan las CPM puede variar según el método de obtención y el tejido de origen, incluso dentro de una misma especie (18-22). A pesar de ello, se acepta de forma general que las CPM son capaces de diferenciarse a adipocitos, osteocitos y condrocitos, presentan forma fibroblástica y son adherentes al plástico de cultivo (15). Las CPM analizadas presentaron marcadores típicos de células madre mesenquimales además de capacidad de diferenciación a tres linajes diferentes.

La combinación de cirugía artroscópica y la administración de CPM produjeron resultados satisfactorios en la recuperación de los pacientes, no precisando antiinflamatorios en dos de los tres casos y temporalmente en el tercero. La eficacia del tratamiento de la osteoartritis canina con CPM autólogas administradas intraarticularmente es bien conocida (9, 10). Sin embargo, no hay antecedentes de la eficacia del tratamiento de la OCD canina con CPM, a pesar de ser la OCD en muchos casos un factor desencadenante y concomitante de la osteoartritis. Los casos tratados en este estudio presentaban estados avanzados de OCD cuya indicación terapéutica paliativa era la cirugía o el tratamiento con antiinflamatorios. El uso de CPM como tratamiento complementario a la artroscopia de limpieza articular fue muy positiva y la evolución clínica de los pacientes muy buena. Cabe señalar que varias articulaciones infiltradas con CPM (una en el caso II y cuatro en el caso III) no habían sido intervenidas previamente con limpieza artroscópica. La evolución de estas articulaciones ha sido muy satisfactoria, lo que puede indicar un efecto terapéutico de las CPM por sí solas.

Debido al bajo número de casos (n=3) el presente trabajo representa un estudio exploratorio en el tratamiento de la OCD canina con CPM. En los animales tratados, las CPM administradas pueden tener un papel antiinflamatorio y reparador, favoreciendo la recuperación y la no reaparición de inflamación (2-6). Sin embargo, el uso sustitutivo del tratamiento de la OCD canina con CPM se tendría que estudiar en animales con un menor grado de OCD o cuando el tratamiento quirúrgico no sea posible. Esto, junto con la comparación contra un grupo placebo o un grupo tratado con antiinflamatorios/artroscopia permitiría evaluar la superioridad o la no inferioridad respectivamente del tratamiento con CPM.

Conclusiones

El tratamiento con CPM de tres perros con OCD no ha producido efectos adversos, a pesar de realizar varias administraciones simultáneas en dos de los casos tratados. La evolución de los animales ha sido satisfactoria, por lo que la administración intraarticular de CPM en el tratamiento de la OCD en perros podría ser una alternativa válida a los tratamientos antiinflamatorios y quirúrgicos clásicos.

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